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PCR反应DNA 复制技术分析推送

2025年05月14日 11:40:57来源:上海抚生实业有限公司

PCR全称多聚酶链式反应(polymerase chain reaction),是一种非常强大的技术,可以通过一种非常简单但是高效的方法来复制DNA,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
复制DNA必要性:
DNA复制是很多研究的基础,例如,当我们对RNA进行测序时,必须先将RNA转化为DNA,并进行大量复制。在对于某个人进行基因组测序时,我们不能对于某个细胞或者单个分子进行测序。测序的基础要求拥有大量的相同的DNA分子拷贝,因此,DNA复制是做生物研究中的基础工具。那么怎么获取这么多拷贝呢?PCR正是一个复印机一般的存在,利用DNA的几个特性,成为批量复制DNA的方法。
PCR原理及步骤:
说到原理,我们就要回顾一下DNA结构:

DNA分子两条单链以双螺旋结构结成,DNA两条链拥有自行粘附的特性,A与T配对,C与G配对,DNA粘附特性是PCR的核心原理。同时DNA复制时也是具有方向性的,DNA序列的开始端称为5‘端,末端称为3’端。
在复制时,需要加入一种叫做引物(primers)的东西。可以将引物理解为一个短序列,下图中红色的部分就是引物。引物通常15到20个碱基,可以短一些,也可以长一些。但是必须和我们想合成的DNA片段成互补关系。将引物与DNA链混合时,会自动粘在上面,因为他们是互补的。引物获得可以从公司订购,后续有机会我们也会分享引物设计方法。

PCR过程分三步:
变性--退火--延伸,PCR中会对这三步循环播放。
A. 变性

在开始准备变性的过程中,要慢慢加热混合物,加热混合物时,两条链间氢键会融化,DNA两股链会分开,就像上图粉色的部分。如果混合物热的情况下,引物不会和DNA黏在一起,两条DNA链也不会黏在一起。
B. 退火
接下来混合物慢慢的冷却,这时引物会黏在DNA上,因为引物较小,更容易漂浮起来,和DNA结合。温度控制在54摄氏度左右可以保证引物序列和DNA互补配对,而DNA双链不会黏在一起。
C. 延伸
这一步我们需要一个帮助DNA复制的工具,即聚合酶链式反应中的聚合酶(polymerase)。下图中绿色的图形就代表着DNA聚合酶,所到之处万物生,这也是我们身体各个细胞中用来复制DNA的工具。聚合酶的作用方式也非常生猛,直接找到部分单链,部分双链的地方,咬住那里的序列开始进行复制。也就是说聚合酶会先找到引物,开始沿着引物进行缺失的序列填充。如下图中看到的,在一轮填充序列后,引物所在的链条(橙色链)会被补齐。这一步中会加入As, Cs, Gs和Ts这些DNA原材料,这样可以把他们整合到新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。这一步的温度稍微高一些,大概是72摄氏度。最初我们加入的是双链DNA,在一个周期后,我们会获得四条链,两个周期后获得8条链,30个周期后,会获得10亿条DNA链。

DNA 复制所需的基本要素:
    DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在 DNA 聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA 在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制 DNA 的变性和复性,加入设计引物,DNA 聚合酶,dNTP 就可以完成特定基因的体外复制,这是 PCR 的理论基础。PCR 反应是在体外模拟 DNA 的复制过程,因此反应体系中必须具有 DNA 复制所需的基本要素:
1、模板(template),含有需要扩增的 DNA 片段。
2、引物(primer),一对引物决定了需要扩增的起始和终止位置。
3、聚合酶(polymerase ),DNA 聚合酶复制需要扩增的区域。
4、脱氧核苷三磷酸(dNTP),用于构造新的互补链。
5、缓冲液(buffer),提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

关键词:PCR反应,DNA 复制技术
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