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凝胶过滤填料的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，后出柱。自GE的葡聚糖凝胶G25问世以来，到现在已经有65年的历史，G系列的填料也是古老和经典的凝胶排阻系列填料，这种填料大的缺点就是不耐压（尤其是G-100和G-200，流体静力压要求非常低）和分辨率差，G25填料一般用于透析和较低分子量多糖或蛋白分离，一般情况G25填料溶胀需要16-24h，溶胀好后的填料从色谱柱侧面看有一种多糖*的乳光。
凝胶过滤填料层析原理：
凝胶过滤：依赖于分子的大小和形状。
吸附层析：依赖于被分离化合物与凝胶之间的氢键数量和质量。
分配层析：依赖于分离化合物在流动相（溶剂）和固定相（凝胶）之间的分配，这主要由样品的极性和溶剂的极性决定的。
凝胶过滤填料可应用于胆固醇、脂肪酸、激素、维他命、天然产物的分析。Sephadex LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
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