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司美格鲁肽
司美格鲁肽，结构见图1[1]，是一种长效的胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)受体激动剂，但近年来，它以“减肥神药”的姿态迅速走红全球，成为抗肥胖治疗领域的重磅药物。其机制来自对GLP-1受体的模拟——这种肠道激素可增强胰岛素分泌、抑制胃排空并作用于大脑中枢，减少饥饿感，让人“吃得少、瘦得快”。数据显示，2023年全球GLP-1类药物市场规模已突破300亿美元，而肥胖市场的扩张使这一数字有望在2028年飙升至700亿美元。在众多GLP-1药物中，司美格鲁肽(商品名如Ozempic用于糖尿病、Wegovy用于减肥)凭借每周仅需注射一次、降重效果显著(平均体重可降低15%以上)，赢得了医生和消费者的广泛青睐。随着市场需求井喷式增长，对司美格鲁肽的高质量、大规模生产也提出了更高要求。司美格鲁肽现有的合成工艺分两类，一类是原研选择的生物发酵结合化学合成的方法完成成品的制备；一类是多肽固相合成以及片段缩合的合成方法。多肽合成工艺过程产生的杂质如氨基酸缺失、取代或插入肽、截断肽等，这些杂质与目标多肽的性质接近，给常规反相液相色谱的分离带来挑战。司美格鲁肽及其相关杂质的反相液相色谱分离使用酸性磷酸氢二铵作为流动相，而磷酸氢二铵是质谱不兼容的流动相。
图1. 司美格鲁肽结构
二维液相
对复杂的多肽杂质问题，传统的一维色谱往往力不从心。尤其是像司美格鲁肽这类杂质性质相近的多肽药物，哪怕是经验丰富的分析专家，也常常陷入“分不清、测不准”的困境。此时，二维液相色谱(2D-LC)技术就像“显微镜+扫描仪”的组合，不仅看得清，还能自动分类、高效识别。二维液相（2D-LC）是一种不改变一维液相分离度和流动相组成且能在线对杂质和目标多肽进行高效鉴定的途径。多中心切割2D-LC可以实现一针样品在线切割多个杂质，然后通过二维泵依次冲洗到二维色谱柱中进行除盐、洗脱和质谱鉴定，图2为仪器流路图。
图2. 多中心2D-LC串联高分辨质谱仪器流路图(e为loop)
仪器配置
Thermo Fisher Vanquish Duo多中心二维液相色谱仪串联高分辨质谱Orbitrap Exploris 120
泵*2：Binary Pump F(PN:VF-P10-A)
自动进样器：Split Sampler FT(PN:VF-A10-A)
柱温箱*2：Column Compartment H(PN:VH-C10-A)
VWD检测器：Variable Wavelength Detector F(PN:VF-D40-A)
质谱检测器：Orbitrap Exploris 120(PN: BRE725531)
一维色谱柱：Hypersil gold peptide 2.1*150 mm 1.9 μm
二维色谱柱：Hypersil gold C8 2.1*50 mm 1.9 μm
实验结果：
1 一维方法重复性
本文采用Hypersil gold peptide小粒径色谱柱和Vanquish Flex超高效液相对司美格鲁肽原料药进行纯度分析，连续进样3次，色谱结果重复性好，见图3和表4。
图3 司美格鲁肽3针一维纯度分析结果叠图
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表4 连续进样3次的峰（图3“√”的3个色谱峰）保留时间和峰面积RSD
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2 多中心2D-LC-MS鉴定
面积归一法进行峰面积计算，对于图4中含量远低于0.1%的峰peak1，分别进行5次在线loop富集，考察在线富集效果。peak1未在线富集进行二维除盐后的质谱图见图5的A和C，C为质荷比1032处放大；peak1进行在线富集5次后进行二维除盐后的质谱图见图5 的B和D，D为质荷比1032处放大，可以看出在线富集效果显著，质谱图的响应达到2.4E5，可以进行有效数据解析。peak1单同位素分子量4125.1021 Da, 在线富集5次后的二级碎片离子覆盖度见图6。
图4中含量高于0.1%的peak2-peak11及主峰，进行直接在线除盐和质谱鉴定。图7和图8展示主峰前的peak2和peak3的质谱定性结果。通过上述方法结合Thermo BioPharmaFinder5.3软件鉴定该司美格鲁肽的杂质有氧化肽、酰胺化肽、缺失肽等。
图4 多中心2D-LC-MS鉴定的峰
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图5 未富集的peak1的质谱图和5次进样在线富集到loop后的质谱图(点击查看大图)
图6 5次富集后的peak1(4125.1021 Da)的二级碎片离子覆盖度(点击查看大图)
图7 peak2(分子量为单同位素峰为3472.7290 Da的缺失肽杂质)的二级碎片离子覆盖度(点击查看大图)
图8 peak3(分子量为单同位素峰为4127.1172 Da的氧化肽杂质)的二级碎片离子覆盖度(点击查看大图)
结论：
1、利用Hypersil gold peptide专用色谱柱和超高效液相色谱Vanquish Flex能对该司美格鲁肽原料药的纯度进行较好的分离，且重复性好。
2、多中心2D-LC-MS对含量非常低的peak1进行在线富集再除盐进质谱响应，比未富集的peak1的质谱响应明显提高。未富集的peak1的质谱数据质量没法进行解析。通过此在线富集方式，可以提高至少5倍的检测灵敏度，该方法对于低含量的物质的鉴定，具有很好的借鉴价值。
3、本方法对于含量不低于0.1%的杂质和主峰进行至少一次实验可以切割5个馏分，然后依次在线除盐进质谱鉴定，鉴定出该司美格鲁肽具有杂质：W25氧化肽、E21酰胺化肽、缺失肽等。多中心2D-LC方法相比较传统的单中心2D-LC方法效率提高5倍。
4、借助变色龙软件eWorkflow的优势，该方法可以便捷地转移到各种多肽类药物、小分子药物、生物药等2D-LC-MS的杂质鉴定。
参考文献：
[1]Sanjay Kalra,Rakesh Sahay.A review on semaglutide:an oral glucagon-like peptide 1 receptor agonist in management of type2 diabetes mellitus[J].2020.06.
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