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非靶向代谢组学能够提供微生物代谢的全局视野，但其应用长期受两大相互交织的问题制约：一是难以将真正来源于细胞活动的代谢物信号，与加合物、源内碎片等 MS 衍生信号及化学污染物等背景干扰准确区分；二是难以在多种营养素同时存在的竞争条件下，定量解析细胞对不同碳源和氮源的利用。传统同位素示踪多追踪单一标记底物的去向，难以回答“多种营养并存时细胞如何选择”这一核心生理问题；现有计算工具多以单峰验证为主，在复杂质谱数据中采用固定的质量与保留时间容差，容易产生随机匹配和假阳性关联，进而干扰对真实代谢网络的理解。
近日，中国科学院上海营养与健康研究所杨立峰研究员研究组与中国医学科学院/北京协和医学院王琳研究员团队合作，在 Analytical Chemistry 在线发表题为“TRACE: An Integrated Isotope-Tracing Framework for Metabolite Validation and Nutrient Fate Mapping”的研究论文。该研究提出了整合稳定同位素实验与计算分析的 TRACE 框架，通过数据驱动的质量与保留时间误差校准、同位素峰网络构建以及营养竞争示踪，实现了从生物来源代谢物验证到碳、氮营养流向解析的一体化分析。
TRACE 整体工作流程：由稳定同位素标记建立高置信代谢物种子，并进一步开展峰网络构建与营养流向分析。
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从“检测峰”到“验证生物来源代谢物”
为了给代谢物建立实验层面的判定依据，研究团队以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK 为模型，设置未标记、¹?N 标记、¹³C 标记和 ¹³C/¹?N 双标记四组样品，并在相应标记条件下连续培养超过 10 代，以尽可能实现充分、均一的稳定同位素标记。由这些同位素示踪底物从头合成的代谢物会依据其碳、氮组成产生可预测的质量位移，为其生物来源提供直接证据。TRACE 并不将这些经同位素确认的峰作为分析终点，而是将其作为高置信“种子”，进一步在全数据集中构建峰—峰(peak-to-peak)关联网络。
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数据驱动的动态容差提升网络特异性
随着检测到的 LC-MS features 数量增加，加之代谢物碳、氮原子数增加会带来更多相近的理论标记质量差，以及同一代谢物可形成多种 MS 衍生形式，候选峰—峰连接数量会快速膨胀。
• 配对数随峰数二次膨胀：峰越多，两两配对的组合数按平方增长；
• 高 C/N 数代谢物：碳、氮原子数越多，理论上可能出现的近似质量差组合越密集，固定 ppm 窗口内更容易出现随机匹配；
• 多种 MS 衍生形式：同一代谢物可形成加合物、碎片和同位素峰，使候选连接规模进一步扩大。
在研究中的一个正离子模式数据集中，共检测到 24,530 个 LC-MS features。这些峰两两组合后，可形成超过 3 亿个潜在连接。上述因素共同决定了：随着数据复杂度上升，预先设置固定的 m/z 与保留时间容差更容易引入随机匹配，这正是 TRACE 引入动态过滤策略的重要原因。
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TRACE 的思路不是直接依赖预设的固定误差，而是利用与理论标记模式高度一致的候选 ¹³C/¹?N 峰束，让数据本身刻画当前实验的实际误差范围。研究发现，高相关候选峰束(Pearson ρ > 0.75)的 m/z 误差和 RT 偏移集中分布在接近零的位置，而背景关联则更加分散。TRACE 据此对真实连接与背景连接的误差分布进行建模，并以拟合信号成分中央 99% 的范围定义动态 m/z 和 RT 容差。需要强调的是，高相关性本身并不足以确定真实连接；候选关系还需同时满足数据驱动的误差边界，才能被保留为高置信连接。经过动态过滤后，保留下来的关系更集中于常见的加合、碎裂和天然同位素形式，同时减少了生物学上不合理的元素同位素偏移和低概率碎裂事件。
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从“同位素种子”扩展到 MS 衍生形式
高置信 CN 种子建立之后，TRACE 进一步将网络扩展至与其相关的 MS 衍生形式，包括同位素对、碎片对和加合物对，并依据相应的 C/N 组成与化学式变化规则对这些关系进行约束。
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TRACE 并不只依赖一对峰之间的质量差，还会检查整个网络中的元素组成和化学转换是否一致。如果某条连接虽然在质量差上满足局部匹配条件，但放入全局网络后无法形成合理、连续的化学转换路径，就会被排除。最终，来自同一化学实体的母离子、加合物、碎片和同位素峰可被归并为一个代谢物特征组，从而减少非靶向代谢组中的冗余特征并提高注释一致性。
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多代高分辨质谱平台拓展代谢组检测空间
除 TRACE 算法本身外，研究还利用同一份稳定同位素标记的酵母提取物开展了跨平台比较，Q Exactive Plus、Orbitrap Exploris 480、Orbitrap Astral 、Orbitrap Ascend Tribrid和 Orbitrap Excedion Pro。研究中，除Q Exactive Plus分辨率设置为14万外，其他平台均设置为12万。同时考察了 Orbitrap Exploris 480 的不同分辨率设置，以及 Excedion Pro 上 120K non-eDR、120K eDR 和 240K eDR 等采集条件。
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在该研究使用的稳定同位素标记酵母样品和相应采集设置下，从 Q Exactive Plus 到 Orbitrap Excedion Pro，总检测 LC-MS features 数量增加 331%；与此同时，经稳定同位素确认的生物来源代谢物绝对数量增加 117%。在 Excedion Pro 上，采用 eDR 和更高分辨率后，可检测的 LC-MS features 数量进一步增加，从而扩展了后续稳定同位素验证和网络分析所面对的候选数据空间。
从方法学角度看，随着可检测特征数量和数据复杂度不断增加，后续数据解析的重要性也随之提升：如何从更加丰富而复杂的检测信号中提取可验证、可归并、可解释的代谢物信息，正在成为深度代谢组学的重要课题。TRACE 所采用的稳定同位素约束与全局网络推断，为这一过程提供了一种具有代表性的分析思路。
从同位素“富集”到“稀释”：解析营养竞争
在完成生物来源代谢物验证后，TRACE 进一步用于营养竞争条件下的代谢流向分析。
传统稳定同位素示踪通常通过加入标记底物，观察同位素在下游代谢物中的出现或富集；TRACE 则采用反向思路。研究人员首先让酵母在 ¹³C-葡萄糖和 ¹?N-硫酸铵标记背景中生长，随后分别加入未标记的亮氨酸、苏氨酸、色氨酸、腺嘌呤、尿嘧啶、乙酸盐或 14 种化合物混合物。当这些未标记营养物被细胞吸收并参与代谢时，会稀释原本来自 ¹³C-葡萄糖和 ¹?N-硫酸铵的标记。
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因此，TRACE 关注的是既有 ¹³C/¹?N 标记被未标记营养物稀释的程度。通过比较营养物补充组与对照组的标记变化，可以评估不同外源营养物在既定标记碳、氮背景下的摄取利用及其代谢去向。
研究发现，乙酸盐主要表现出 C2N0、C4N0 和 C6N0 的碳贡献模式，与其以 C2 单元进入中心碳代谢的方式一致；苏氨酸主要贡献 C4N1，腺嘌呤则表现出显著的 C5N5 贡献模式。这些同位素稀释特征与相应营养物的化学组成和已知代谢途径高度一致。
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进一步以谷胱甘肽(GSH)和 NAD+ 为模型，研究分别验证了 TRACE 对不同复杂度代谢网络的解析能力。GSH 作为相对线性的组装模型，其同位素模式能够对应组成氨基酸的碳、氮来源，验证了 TRACE 对直接前体掺入关系的解析能力；NAD+ 则作为多通路汇聚模型，进一步展示了 TRACE 对嘌呤补救与从头合成、色氨酸代谢以及谷氨酰胺来源氮等多源贡献的解析能力。
TRACE 通过同位素稀释解析不同营养物的碳、氮去向，并分别以 GSH 和 NAD+ 验证线性组装与复杂汇聚代谢网络。(点击查看大图)
从“峰列表”走向“功能代谢网络”
总体而言，TRACE 将稳定同位素示踪、动态误差校准、全局峰网络和营养竞争分析整合到统一框架中，实现了从代谢特征检测、生物来源验证到营养流向解析的连续分析。研究还在 Q Exactive Plus、Orbitrap Exploris 480、Orbitrap Astral 、Orbitrap Ascend Tribrid和 Orbitrap Excedion Pro等多个高分辨质谱平台上开展了跨平台比较，展示了稳定同位素信息与高分辨质谱检测能力结合在深度代谢组学研究中的应用潜力。
该研究表明，稳定同位素不仅可以用于追踪代谢物中的元素去向，还能够作为实验约束条件辅助非靶向 LC-MS 特征归属。在此基础上，TRACE 进一步将代谢物验证与营养来源解析连接起来，为从复杂质谱特征中构建具有生物学意义的代谢关系网络提供了一种实验与计算相结合的方法学框架。
作者信息：
中国科学院上海营养与健康研究所李锐博士后为论文第一作者，杨立峰研究员与中国医学科学院/北京协和医学院王琳研究员为论文通讯作者。研究得到科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国医学科学院医学与健康科技创新工程、中国科学院上海分院人才计划等的资助，同时得到中国科学院上海营养与健康研究所所级公共技术中心、赛默飞世尔科技质谱技术支持以及中国医学科学院生物医学高性能计算平台的支撑。
论文信息：Li R, Wang J, Shan Y, et al. TRACE: An Integrated Isotope-Tracing Framework for Metabolite Validation and Nutrient Fate Mapping. Analytical Chemistry, 2026. DOI:10.1021/acs.analchem.6c02292.
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